細胞內蛋白質樣品萃取與製備
線粒體/細胞質分離試劑盒
K256-25 Mitochondrial/Cytosol Fractionation Kit 25 assays
K256-100 Mitochondrial/Cytosol Fractionation Kit 100 assays
該試劑盒用於分離凋亡或非凋亡的哺乳動物細胞的細胞質和線粒體，可進行凋亡研究，或用Western Blot、ELISA來檢測，目標蛋白於細胞質和線粒體的localization情況。
細胞核/細胞質分離試劑盒
K266-25 Nuclear/Cytosol Fractionation Kit 25 assays
K266-100 Nuclear/Cytosol Fractionation Kit 100 assays
試劑盒內包含，分離哺乳動物細胞的細胞核和細胞質所有試劑，不僅能夠分離細胞核和細胞質蛋白質，而且可以保持蛋白質的完整性。所分離的細胞核和細胞質蛋白質可進行轉錄活性、RNA 剪接、凝膠阻滯電泳實驗、報告蛋白檢測、酶活性檢測及Western Blot 研究等。
細胞質/胞內顆粒快速分離試劑盒
K267-50 Cytosol/Particulate Rapid Separation Kit 50 assays
試劑盒利用物理學原理，通過一個油層將細胞質和胞內顆粒快速分開，使得兩個蛋白質不能互相接觸或彌散，進而實現對蛋白質進行精確的亞細胞定位和分析。
膜蛋白抽提試劑盒
K268-50 Membrane Protein Extraction Kit 50 assays
該試劑盒提供最佳化的緩衝液和試劑，用來高效地萃取哺乳動物組織和細胞的膜蛋白。傳統的方法或試劑盒僅能提取總的細胞膜蛋白，包括漿膜和細胞器膜蛋白。該試劑盒不僅能分離總的細胞膜蛋白，還可以單獨純化漿膜蛋白(plasma membrane protein)。試劑盒所抽提出的膜蛋白可用於Western Blot，二維電泳和酶活性分析等多種檢測方法。
哺乳細胞蛋白抽提試劑盒
K269-500 Mammalian Cell Extraction Kit 500 assays
該試劑盒內含有最佳化的緩衝液和試劑，用於從培養細胞和組織中非變性地萃取哺乳動物蛋白，所得到的細胞裂解物可用來酶活性的檢測 (如Caspase 活性測試)、Western Blot 等多種用途。
四合一胞器分離試劑盒
K270-50 Fraction-PREPTM Cell Fractionation System 50 assays
該試劑盒能從一個哺乳動物樣本中抽提出四種蛋白質，細胞質、細胞核、膜/顆粒及細胞骨架組分等。方法簡單、快速，整個過程只需2 小時；無需超速離心；結果重複性好； 所分離的蛋白質可用於一維或二維電泳。
胞器蛋白分離的應用(一)
目的: 探討細胞核內轉錄因子和特定DNA序列相互作用
應用: 檢測蛋白質和一段特定DNA序列(label)相互結合的技術
原理: 當特定序列的DNA和某蛋白質結合後，整個蛋白質複合體分子量會增加,經由電泳後,在gel中的移動速度變慢,整個band進上shift.
可加入特定抗體檢測是否有特定蛋白質Binding( Supershift)
胞器蛋白分離的應用(二)
應用: 細胞凋亡時,粒線體膜電位去極化的過程會增加膜的通透性並使膜內蛋白,如Cytochrome C, AIF, Smac/DIABLO等分子釋放到細胞質中,引發caspase-9活化, 造成一連串凋亡反應發生. COX4蛋白位於粒腺體細胞內側, 並在Apoptosis發生時依舊保留在粒線體內。
胞器蛋白分離的應用(三)
應用: 二維電泳與MDLC(液相層析)並列為研究蛋白質體學的重要技術之一
原理: 利用分子量(一維)與等電點(二維)一次可分離大約2000個蛋白質
限制: 膜蛋白(Hydrophobic)在電泳中不易看到.蛋白質若是為low abundant protein則欲得到準確而可信的實驗結果要做胞器分離( sample prefractionation) 胞器分離在2d應用的優點:
1. 移去abundant protein
2. 增加 low abundant protein
3. 減少蛋白質的複合體發生
胞器蛋白分離的應用(四)
以FractionPREP Cell Fractionation Kit的操作方法為例:其它組kit方法雷同
操作方法
1. 收集4~8x106~400mg組織/1ml PBS,700xg離心5分, 以5~10ml的預冷PBS wash,後以700xg再離心5分
2. 將細胞重新懸浮於1ml的預冷PBS,700xg 離心5分,並移去supernatant.
3. 加入400ul cytosol extraction buffer-mix(已加DTT及Protease inhibitor cocktail) pipette數次以混合細胞
4. 冰上放置20分鐘作用, 每5分翻轉3~4次
5. 將sample700xg離心10分鐘, 並收集supernatant----
à所得到為cytosolic fraction
6. 將留下的pellet再加入400ul 預冷的membrane extraction buffer A mix, pipetter 10~15秒以混合均勻
7. 加入22ul的membrance extraction buffer-B 振盪5秒後冰上靜置1分
8. 再振盪5秒後以1000xg離心5分,收集supernatatn於預冷的tube
à所得為membrane/partivulate fraction
9. 將pellet再加入200ul預冷的Nuclear extraction buffer mix, 振盪15秒後,冰上放置40分,每10分振盪15秒
10. 高速離心10分, 將supernatant 轉移至新的預冷之tube—
à所得為nuclear fraction
11. 最後所留下的pellet,再溶於100ul buffer(0.2% SDS, 10mM DTT)irm SDS-PAGE sample buffer)
à所得為cytoskeletal fraction
